基于CRISPR-Cas的基因组编辑系统推动了生物学和医学研究向更多的方向拓展，它也成为了探究疾病遗传学机制、开发基因疗法和细胞疗法的核心工具。许多基础研究、基因疗法和细胞疗法的研制在很大程度上都是基于原代细胞样本，如何将CRISPR-Cas基因组编辑系统简单、高效地递送到原代细胞中并同时保证良好的耐受性在目前仍然是一个重大挑战。近期，宾夕法尼亚大学的研究团队在《自然》杂志子刊Nature Biotechnology上发布了他们开发的一种工程化的肽辅助（PAGE）基因组编辑系统，该系统可以快速、有效地编辑原代细胞，并将毒性降至最低，其编辑效率可高达98%以上。
CRISPR-Cas源自古老的细菌抗病毒防御机制，旨在精确去除细胞基因组中目标位置的DNA。基于CRISPR-Cas已经衍生出了多种基因组编辑系统，一些系统将去除旧DNA和插入新DNA结合起来，从而实现多功能的基因组编辑。这种技术可以用来纠正有缺陷的基因，或者删除/修改基因以增强细胞功能。此外，一些系统还可以添加基因，为CAR-T细胞赋予新的特性，例如识别肿瘤的能力或在免疫抑制性的肿瘤微环境中仍能发挥免疫效力的能力。
将CRISPR-Cas系统直接递送到原代细胞中需要经过以下几个过程：细胞渗透、核内体逃逸（endosomal escape）以及核定位，由于基因编辑系统组件尺寸较大并且呈聚离子特性，它们实际很难穿过细胞膜。此外，溶酶体中的酸性环境可能会导致CRISPR-Cas复合物降解从而影响编辑效果。当前的递送方式主要包括病毒载体、电穿孔和纳米颗粒，但这些方法的流程十分繁琐并且可能会带来细胞毒性。
为克服这些缺点，宾夕法尼亚大学的科学家们对现有的CRISPR-Cas系统进行了升级，他们设计并构建了一种肽辅助的CRISPR-Cas系统（以下称为CRISPR-PAGE系统）。和常规的基因组编辑工具相比，这种系统包含了可渗透入细胞的Cas蛋白（如Cas9或Cas12a）以及核内体逃逸肽——这些通常是病毒用来帮助它们进入细胞及细胞核的组分，通过这种改造可以增强该系统的细胞渗透性和核定位能力。
科学家们在小鼠和人类原代T细胞上测试了CRISPR-PAGE系统的编辑效果。只需与上述蛋白/肽分子孵育30分钟，就可以让CRISPR-PAGE系统实现高效的基因组编辑。此外，他们还在人类CAR-T细胞上对这一系统进行了测试，以观察它是否能被用于常规的CAR-T细胞制造流程，以克服电穿孔技术的缺点——该技术一般被用于将CAR的mRNA转录本导入T细胞中。结果显示，CRISPR-PAGE系统的细胞毒性更小，编辑效率高达98%——经处理后，有98%的细胞成功表达目标CAR，而经电穿孔处理的T细胞中这一比例仅为68%。对处理前后的CAR-T细胞进行转录组分析，发现CRISPR-PAGE系统对于细胞生长、抗肿瘤活性和整体转录活动没有明显的不良影响。
接下来，科学家们探索了如何增强这一系统在CAR-T细胞中的基因编辑能力。他们发现，采用多种sgRNA分子混合的方式比采用单一sgRNA分子的效果更好，同时提高辅助核内体逃逸肽的浓度可以显著提高CRISPR-PAGE系统的敲除效率，由此产生的CAR-T细胞可在体外扩增超过10天，并且细胞存活状况和未经基因编辑处理的细胞相比没有显著差异。
此外，科学家们在人类CAR-T和造血干/祖细胞（HSPC）中测试了CRISPR-PAGE系统的多重基因编辑能力，评判标准为目标基因在细胞中的敲除效率。和预计的一样，该编辑系统的细胞毒性较小，约50.9%的细胞实现了双敲除，实现了单个目标基因敲除的细胞比例约为44.7%（B2M基因敲除）和1.8%（PTPRC基因敲除）。对于两种基因的敲除效率差异，科学家们认为这可能是由于敲除的先后顺序导致的（B2M在先，PTPRC在后）。在三重基因敲除的实验中，该编辑系统的表现同样出色：同时实现三个目标基因敲除的细胞比例高达88%，安全未经编辑的细胞比例仅为1.3%，其余的细胞则分别为单基因敲除或双基因敲除。
BCL11A是一种在红细胞中抑制胎儿血红蛋白（HbF）基因表达的转录因子。通过靶向其红细胞特异性内含子增强子（+58 kb）来调控BCL11A基因表达的传统基因编辑疗法正在用于治疗镰状细胞病和某些形式的β-地中海贫血的临床研究。在人类造血干/祖细胞中，CRISPR-PAGE系统和基于电穿孔的传统基因编辑方法对BCL11A基因增强子区域的编辑效率都接近100%。与电穿孔处理的细胞相比，CRISPR-PAGE系统编辑的HSPCs在6天扩增后产生了大约三倍的红细胞，这表明CRISPR-PAGE系统对细胞活力的影响要小于电穿孔。
最后，科学家们通过对NFIA和NFIX进行双重敲除，再次验证CRISPR-PAGE系统在HSPCs衍生的祖细胞中的多重编辑能力，这两个基因最近被鉴定为HbF抑制因子。相应地，CRISPR-PAGE编辑介导的NFIA和NFIX双敲除在mRNA和蛋白质水平上导致了HbF的再激活。这些数据证明CRISPR-PAGE系统可以作为一种简便而高效的方法进行体外造血祖细胞基因编辑，并为将CRISPR-PAGE系统推广应用于原代造血谱系细胞的基因工程改造提供了有力的支持。
除了在细胞和基因疗法中的潜在用途之外，作者指出CRISPR-PAGE系统可以在基础科学研究中得到广泛应用。鉴于其高效率和低毒性，它可以在小鼠中实现快速、高效和简便的基因编辑，让动物模型的构建更为便捷。总的来说，本研究的结果表明，CRISPR-PAGE系统为快速、高效地递送基因编辑组件提供了一个可推广的技术平台，有助于促进针对原代细胞的下一代基因工程技术发展。