由分泌型和膜结合型蛋白质构成的细胞外蛋白质网络错综复杂，它们在细胞间通信和生理调节中扮演关键角色。细胞外蛋白质网络长期被视为药物研发中的重要治疗靶点，近年来，细胞外靶向蛋白降解（eTPD）技术的出现为研究人员提供了一种新颖的方法来调节细胞外蛋白质组。不同于传统基于占位机制的药物，eTPD技术运用双特异性抗体、偶联物或小分子，将细胞外蛋白质靶点转移到溶酶体进行选择性降解，这种独特的方法不仅拓展了可治疗的靶点范围，还为治疗多种疾病开辟了新的可能性。近日，《自然》杂志子刊Nature Reviews Drug Discovery发布了一篇综述文章，深入剖析了eTPD技术的最新研究进展、及其在药物发现领域的潜在应用和未来展望，在今天的文章中，药明康德内容团队将与读者分享其中的精彩内容。
什么是细胞外靶向蛋白降解，它有什么与众不同的地方？
细胞外蛋白质组是一个由分泌型或膜结合型蛋白质组成的庞大网络，涵盖了多种蛋白质，如生长因子、细胞因子、激素、酶和受体等，这些蛋白质参与了各种细胞机制，包括细胞信号传导、免疫反应、组织修复和新陈代谢。由于许多疾病与细胞外蛋白质的失衡有关，细胞外蛋白质组成为药物发现的关键靶标。因此，深入了解细胞外蛋白质组及其功能对于制定有效的治疗策略和干预措施至关重要。
eTPD是药物发现领域的一种创新方法，它通过使用双特异性抗体、共轭物或小分子来选择性地降解细胞外蛋白。这种方法与传统的占位型药物截然不同，后者通过结合来抑制靶蛋白的活性，而eTPD则使用能同时与靶蛋白和细胞表面回收受体结合的双特异性药物。这种结合触发了目标蛋白的内化过程，导致其被输送至溶酶体并发生降解。与传统药物相比，eTPD方法具有多种优势。它不仅具有更高的选择性和减少脱靶效应的潜力，而且还能够靶向那些以前被认为难以通过药物治疗的蛋白质。这一方法为药物发现开辟了新的路径，尤其是在处理那些难以用传统方法靶向的细胞外蛋白质时。
除了靶蛋白所处的位置不同之外，eTPD与细胞内靶向蛋白降解（iTPD）之间还至少存在三个显著区别。首先，细胞通过蛋白酶体和溶酶体两条主要途径回收蛋白质。iTPD主要利用蛋白酶体途径，专门用于细胞内蛋白质的处理。而eTPD则涉及双特异性生物制品或小分子，招募膜结合型或分泌型蛋白质靶标到膜结合型回收受体，并将其运输至溶酶体进行降解，这是细胞外蛋白质降解的常用途径。
其次，iTPD和eTPD在蛋白质水解破坏过程中的动力学特性和所用蛋白酶不同。iTPD反应更快——通常在几分钟到几小时内即可完全启动，因为所有相关组分均位于细胞质中。相比之下，eTPD通常较慢，一般在6至48小时内开始作用，涉及的过程包括蛋白从膜到早期和晚期内质体的囊泡运输，最终与溶酶体融合并进行蛋白降解。
第三，iTPD系统主要依赖于Cereblon（CRBN）和Von Hippel–Lindau蛋白（VHL）这两种E3连接酶，CRBN和VHL类E3连接酶的表达普遍存在于多种组织中，这一事实为开发具有组织特异性的蛋白降解药物带来了显著挑战。随着科研的不断深入，目前已识别出600多种E3连接酶，最近进行的全基因组筛选研究则进一步揭示了更多蛋白质降解机制，这为识别和利用新的蛋白降解剂提供了可能。与iTPD相比，eTPD已经开始使用更多样化的蛋白降解机制，这不仅增加了蛋白降解方案的可选择性，还提高了组织特异性，从而为治疗相关疾病提供了更广泛的治疗策略。
在细胞外靶向蛋白降解领域，针对可溶性和膜结合型蛋白质靶标的降解引起了广泛的兴趣。为此，研究人员已经开发了多种蛋白降解策略，这些策略利用了不同的自然回收和细胞内化机制，以实现对这些靶蛋白的有效降解。
方法一：采用“清除抗体（sweeping antibodies）”IgG分子
“清除抗体”分子经过工程改造，增强了它们与Fc回收受体、新生儿Fc受体（FcRn）或FcγRIIb的结合能力，此外，它们在中性pH条件下具有与目标蛋白（POI）结合的pH敏感性互补性决定区域，但在细胞内化这些复合物并进入酸化的内质体后，能够释放目标蛋白。这一过程导致目标蛋白被运送至溶酶体并降解。与Fc受体结合的抗体随后被回收至细胞表面，在那里它们可以继续捕获更多的目标蛋白。
方法二：采用靶向糖基的回收受体
非阳离子依赖的甘露糖6-磷酸受体（CI-M6PR）或唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）等受体能够促进膜蛋白和可溶性蛋白的溶酶体降解。一种可行的方法是将多个糖基配体以生物共轭的方式连接到靶向特定目标蛋白的抗体上，以创建溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）。LYTAC–POI复合物与CI-M6PR结合后，会被细胞内化并运送至溶酶体中，导致POI的降解。此外，研究人员已经开发了生物制品和双功能小分子构建物，采用类似的方法来利用ASGPR进行蛋白降解。
参考阅读：《科学》重磅！诺奖得主Carolyn Bertozzi团队揭示LYTAC最新调控机制
方法三：利用双特异性抗体对跨膜E3连接酶进行开发利用
这种方法涉及使用双特异性抗体来开发利用跨膜E3连接酶。在这些抗体中，一个臂结合到E3连接酶的细胞外结构域，而另一个臂结合到跨膜POI的细胞外结构域。这些构建物被称为基于抗体的蛋白降解靶向嵌合体（AbTACs）、蛋白降解靶向抗体（PROTABs）或通过E3泛素连接酶招募的受体消除（REULR）。此方法通过将降解剂与POI靠近，触发POI的细胞内结构域泛素化，并将其定向至溶酶体或蛋白酶体进行降解。
方法四：开发KineTACs——利用双特异性抗体构建物结合天然细胞因子和生长因子的回收受体
KineTACs是一种双特异性抗体构建物，在这些构建物中，一个臂结合到天然细胞因子或生长因子，而另一个臂专门结合到POI上。这使得KineTACs能够针对膜结合型和可溶性蛋白发挥作用，实现高效且特定的蛋白降解。
方法五：利用整合素促进的溶酶体降解技术
这种方法涉及使用双特异性抗体，其中一个臂专门结合到整合素，而另一个臂结合到POI。这种方法被称为整合素促进的溶酶体降解，通过这种方式，可以有效地将POI引导至溶酶体进行降解，同时利用整合素的循环能力来增强目标定位和效率。
方法六：采用小分子靶向蛋白降解嵌合体（PROTACs）
这种方法涉及使用小分子PROTACs，这类分子中的其中一部分专门设计用于结合到受体酪氨酸激酶（如表皮生长因子受体，EGFR）的细胞内激酶结构域，而另一部分则结合到细胞质中的E3连接酶。这种双特异性结合可以触发受体酪氨酸激酶的泛素化，进而导致其在蛋白酶体中被降解。PROTACs技术为靶向细胞内蛋白质提供了一种高效的降解策略。
除了前述的基于抗体和小分子的eTPD策略之外，还有几种基于生物制品的靶向蛋白降解方法被报道。这些方法旨在降解细胞内和与膜相关的靶蛋白，包括：
“Trim-away”系统
TRIM21是一种E3连接酶，最近的研究发现它能够天然降解来自病毒的内化抗体复合物。当带有抗病毒抗体的病毒进入细胞质时，抗体的Fc部分会与TRIM21结合，引发泛素化和蛋白酶体降解的过程。这个系统可以被用作一种有用的工具，通过短暂渗透细胞处理，使抗体接触到靶标并结合到TRIM21上，从而降解目标蛋白。尽管这种“Trim-away”系统在治疗上可能不太实用，但它表明外部生物制品可以利用自然的降解机制来实现靶标的移除。
生物蛋白降解靶向嵌合体（bioPROTACs）
研究人员开发了一种名为生物蛋白降解靶向嵌合体（bioPROTACs）的方法，通过基因融合编码一个小结构域结合物，用于降解细胞内目标蛋白。这些结合物被融合到五种不同E3连接酶类别上，其中正常的底物结合域被替换为与POI结合的结合物。BioPROTACs通过慢病毒转导入细胞，实现了对GFP或增殖细胞核抗原（PCNA）的高效降解。研究人员发现，使用不同类型的结合物都能实现显著降解，但KDs值弱于200 nM的结合物并不有效。这种策略为生物学家提供了探索特定E3连接酶对特定靶标的降解如何调节POI功能的工具，并有望在动物甚至人类靶细胞中表达。
基于纳米抗体的PROTAC
近期，研究人员开发了一种能穿透细胞的纳米抗体，专门靶向BCL-11A转录因子，该因子负责促进从胎儿血红蛋白（HbF）到成人血红蛋白（HbA）的转变。某些携带突变HbA编码基因的患者可能会发展成β-地中海贫血或镰状细胞病，而通过切换回HbF编码基因可以缓解这些疾病。研究人员利用酵母研究模型进行测试，从合成的纳米抗体库中筛选出能够特异性结合到BCL-11A中的ZnF23ex而非BCL-11B的纳米抗体。然后，将这些纳米抗体与Fc融合，使其能结合到TRIM21，并通过慢病毒转导进入永生化的红系祖细胞系HUDEP2，在不影响BCL-11B表达下，实现了对BCL-11A的约50–70%选择性降解。此外，研究人员还将一个细胞穿透肽与抗体的N端连接，并融合了两种不同的核定位E3连接酶结构域，从而构建了一种细胞穿透型纳米抗体–PROTAC。这些构建物展示了外源性递送的bioPROTAC蛋白可以有效实现细胞内POI的降解，并具备可设计的理想功能输出。
蛋白酶工程用于分离癌症相关黏蛋白
研究人员开发出一种新型方法，通过设计一种能够特异性分离细胞表面与疾病相关的黏蛋白的黏蛋白酶，利用溶酶体进行细胞外靶向蛋白降解。这些黏蛋白是与癌症相关的蛋白，可能在癌症进程中发挥作用。研究发现，大肠杆菌的金属蛋白酶StcE可以切割这些黏蛋白，进而逆转癌症的表型。通过将此酶与肿瘤靶向部分连接，实现了对肿瘤细胞特异性的活性定向。在小鼠研究中，此方法在机械信号传递和癌症原位模型上展现了低毒性和高效性。
未来展望
eTPD领域正处于快速发展阶段，其分子设计和生物制剂方法的多样性不断增长。然而，该领域在其演进过程中依然面临众多尚未解决的关键科学问题。这些问题涵盖了确定eTPD的优势靶标、辨识在治疗领域中受关注度最高的蛋白质靶点以及评估其在治疗慢性病与急性病方面的相对功效。进一步的问题包括，eTPD主要针对的靶标是可溶性POI、膜结合型POI，或是两者兼而有之？此外，从药物安全性和有效性角度来看，组织特异性的重要性、有效降解剂的数量、降解系统容量的充足性，以及抗药性机制的出现概率等，均为该领域需要关注的重点。
总体来说，eTPD的兴起代表了药物发现领域的一次重大突破，为针对细胞外蛋白质组的选择性调控及其治疗应用开辟了新途径。鉴于其在癌症治疗、免疫调节、神经退行性疾病以及传染病等领域的应用潜力，eTPD正显现出作为一种多功能性治疗策略的广泛意义。展望未来，eTPD的研究重点将聚焦于实现多重靶向、提高组织选择性以及促进临床应用的发展。同时，解决抗药性机制、减少脱靶效应、以及实现商业化将是实现eTPD疗法潜力的关键。随着该领域的不断研究和创新，eTPD有望对药物发现产生深远影响，并为下一代靶向疗法的开发奠定基础。在挑战与机遇并存的背景下，eTPD领域继续充满创新和期待，我们期待未来迎来更多重要的科学发现。